Flp-FRT定点整合稳定细胞株
▏ 名词定义
Flp: Flp(flippase recombination enzyme)重组酶，是从酵母细胞内被发现的，其基因全长1272bp，为48kDa大小的、由423个氨基酸组成的多肽单体蛋白。
FRT: FRT(Flp Recombination Target)是Flp的识别位点，全长48bp，由3个13bp的反向回文序列和8bp的间隔序列共同组成。与间隔序列相邻的两个反向回文序列是Flp重组酶的识别和结合区域，间隔序列是重组发生的区域，也决定了整个序列的方向。
▏ Flp-FRT定点整合系统
Flp-FRT整合系统是一种用于构建稳定细胞系的方法，该细胞系可在宿主细胞基因组的特定位置表达目的基因。该系统利用 Flp 重组酶和 FRT（Flp 重组靶位）位点实现位点特异性重组和整合。该系统可实现目的基因的稳定表达，确保细胞中蛋白质的持续生产。
▏ 工作原理
1. Flp-FRT细胞的构建： 将 Flp 重组靶位 (FRT) 位点引入宿主细胞系的基因组中，一般结构是ATG+FRT+抗性基因，根据母细胞选择转染方案，利用抗性筛选，可以得到稳定细胞株。 K8凯发(中国)思考1：一般认为这一步的构建，FRT会整合到细胞的转录活跃区位置，也就是说为了后续的重组外源目的基因的表达，这一步的整合给了外源蛋白过表达给予了一定的保障。 K8凯发(中国)思考2：作为常规的质粒转染方案，宿主细胞能整合几个拷贝进去？选择几个拷贝为好？一般而言构建Flp-FRT母细胞时，转染后是随机整合，也就是会存在多个拷贝整合到宿主细胞的不同染色体位置。整合的越多，未来目的基因重组整合的也多，也就是表达会更高，但是反过来未来重组目的基因时，多个拷贝的整合效率可能不是100%的，也就是会出现混合克隆（克隆间表达高低不一致），有时针对不需要表达很高的目的蛋白，K8凯发(中国)建议选择1个拷贝的整合克隆，这样未来只要经过抗性筛选的克隆，从原理上说就是单克隆，省去了有限稀释做单克隆的过程。 K8凯发(中国)生物内部现货Flp-FRT细胞 Cell line Host cell line Characteristic Flp-FRT CHO CHO-K1 Adherent Flp-FRT HEK293 HEK293 Adherent Flp-FRT HCT116 HCT116 Adherent Flp-FRT Jurkat Jurkat Suspension 2. 目的基因的整合： 将含有目的基因的表达载体、含有Flp重组酶的表达载体共转入第一步中的细胞。在Flp 重组酶的介导下，宿主基因组中的 FRT 位点与表达载体中的 FRT 位点之间的位点特异性重组，达到目的基因整合的目的，在启动子的作用下，稳定表达。 载体一: 过表达Flp重组酶，无需抗性，无需稳定整合 载体二: 含有目的基因，第二种抗性基因筛选标记 重组过程： 最终形成： 重组后，可以顺利获得第二种抗性基因来选择得到阳性细胞，改细胞对抗性基因-2耐受，对抗性基因-1敏感
具体的整合位置可以咨询K8凯发(中国)的ISS（integration site search）服务。
▏ Flp-FRT系统的优势
1 定点整合，不会随机整合穿插到染色体的任意位置； 2 可控拷贝数，可以顺利获得Flp-FRT细胞的拷贝数来控制目的基因的拷贝数； 3 稳定表达，相对于随机整合，该表达系统更稳定，同时可以同抗性基因2筛选，用抗性基因1验证； 4 表达量高，重组酶整合效率高，且整合在转录活跃区； 5 实验周期短，选择单拷贝的基因组，可以省去有限稀释制备单克隆的过程。
▏ 稳定细胞株构建服务
K8凯发(中国)生物给予“Flp-FRT定点整合系统”稳定细胞株构建服务，利用该系统，K8凯发(中国)已经成功构建超过200株稳定细胞株的模型，有着丰富的经验，欢迎沟通咨询。 质粒转染 病毒感染 Flp-FRT系统 转座子系统 基因编辑 脂质体 电转 慢病毒 适用细胞 部分细胞 几乎所有细胞 几乎所有细胞 内部4种细胞 几乎所有细胞 部分细胞 转染/感染效率 低 中 高 高 高 低 随机整合 是 是 是 否 - 否 生物安全等级 BL1 BL1 BL2 BL1 BL1 BL1 基因装载能力 - - <4-5k - - - 阳性率 低 高 高 高 高 低 周期 基因合成 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 病毒包装 - - 1周 - 混合克隆筛选 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 单克隆筛选 >3 周 >3 周 >3 周 可选 可选 >3 周 合计 > 8-10 周 > 8-10 周 >9-11周 5-7 周 5-7 周 > 8-10 周 工作负荷 高 中 中 低 低 高
